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實驗室百科 | 淺談幹細胞實驗室的建設與管理

1968年，世界首例骨髓移植術治療重症聯合免疫缺陷患者，開啟了幹細胞的醫學應用之門。

2018年，全球幹細胞產業市場規模超千億美元，十餘款幹細胞產品獲批上市。

未來5年將有更多幹細胞藥物獲批。我國近年來在幹細胞及轉化研究領域亦取得了長足進展，相關幹細胞產品已進入Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗階段。

臨床級幹細胞庫是標準化收集、處理、儲存、檢測和分發不同來源的幹細胞以及與幹細胞相關的臨床、病理、治療、隨訪、知情同意等資料，並進行質量控製、信息管理與應用的專門機構或部門。

目前，日本、以色列等國的科學家正利用誘導多能幹細胞重組技術建立不同人群的臨床級幹細胞庫，利用幹細胞庫進行標準化製備和應用已成為國際主流趨勢。

上海市東方醫院為國家首批幹細胞臨床研究與項目備案機構，通過打造細胞種子庫、主細胞庫和工作細胞庫良好操作規範（GMP）製備室與質檢平台，建成了較大規模的臨床級幹細胞庫，並開辟了第三方存儲服務，促進了幹細胞臨床應用的可持續性發展。

建設臨床級幹細胞庫是搶占優質資源戰略高地的核心，本文依據幹細胞研究相關國內外規範，闡述臨床級幹細胞庫的建設與管理，以期為建庫機構提供有益借鑒。

臨床級幹細胞庫的建設與要求

一、如何選址

臨床級幹細胞庫應選擇安全、無幹擾的獨立與封閉區域，遠離嚴重汙染(空氣、水、病原微生物、放射性同位素等)，遠離振動/噪聲，盡可能毗鄰樣本采集與臨床治療點，減少樣本的轉運時間，便於及時處理與製備，實現流程無縫對接。存儲區優先選擇地麵以上較低樓層，避免雨水/洪水倒灌，防黴防潮，保持良好的溫濕度。

二、功能區規劃與管理

（一） 核心功能區與輔助區

核心功能區，涵蓋樣本與細胞收發室、製備與處理室、存儲區、質檢室與總控室，必要時設置接待征詢室和采集室。細胞製備的潔淨區域應具備緩衝區、更衣室，滿足細胞的分離、擴增與培養，各製備套間周圍設置潔淨的走廓，增加流程的靈活性。細胞製備操作區應設立潔淨區，根據《GB50073潔淨廠房設計規範》，潔淨區麵積規劃一般為2～4m2/人，潔淨區滿足GMP要求，其設計、建設、管理、進出、使用、清潔、消毒、環境檢測等參見《藥品生產質量管理規範》無菌藥品附錄[13],幹細胞製劑的生產必須在B級背景下的A級潔淨區完成。根據功能需求杜絕汙染，必要時設置隔離區，避免隔離區的空氣進入其他區域；為減少不同批次細胞在研究中的變異性，在製備階段應對同一批特定代次的細胞建立多級細胞庫區，庫區應防止混淆、差錯和交叉汙染。輔助功能區包括辦公室、會議室，檔案室，庫房及洗消室等。

（二）流程與流向

布局的流程與流向應合理有序並明確標識，設置人員、物料、細胞、汙物流向與醫療廢棄物專用通道，確保生物安全，減少汙染風險，為了便於樣本、試劑、物料與細胞製劑按規定的流程和流向傳遞，可在入口與出口處合理設置傳遞窗，提高工作效率。

三、 人員配備

應建立與業務相適應的組織架構，明確管理路徑、職責、權限及相互關係，配備相應資質(職稱、學曆、培訓和實踐經驗)的操作人員和管理人員。對人員培訓、考核並評估效果，采集人員需經培訓合格並持有醫師或護士執業證書，采集信息雙人複核；製備人員應進行無菌服穿戴的培訓；製備、質量管理負責人與質量受權人不得相互兼任；如個別崗位職責需委托他人，受委托人應同樣滿足該崗位職責的資質要求，委托人仍然承擔最終責任。

四、設施與設備

應為所有設施設備設計充足合理的空間，根據各區域麵積及功能規劃供暖、通風(自然/壓力)、空調、水電、照明、滅菌、監控、溫濕度、氧濃度、消防、汙水與醫療廢棄物處理係統等，並定期清潔、維保、校準和質檢，製定應急預案。應監測生物安全櫃、潔淨室的顆粒及生物負載係統，包括高效微粒空氣過濾係統、A/B潔淨室內的空調淨化係統；應規定監測頻率和監測項目，如靜態和動態下的懸浮粒子、沉降菌、浮遊菌、表麵微生物、壓差、風速、溫濕度等；對於B級背景下的A級區應采用在線塵埃粒子監測係統懸浮粒子；定期清洗和更換初、中效過濾器，並定期在工作狀態下對高效過濾器進行檢漏，以防止損傷和泄漏。

存儲庫區應充分考慮樓麵承重，設施設備規劃與安全管理遵循《ISBER最佳實踐2018》[14]，如配備雙路供電或應急發電設施及備用存儲空間、冷鏈監控等；縮短液氮塔到庫區的距離，減少氮氣的耗損；液氮與幹冰區域應配備氣體監測器、聲光報警和排風係統，一旦房間內氧濃度低於設定的下限時自動啟動強排風，液氮區地麵杜絕使用磁磚，優選耐低溫的環氧樹脂，冰箱區應充分考慮散熱，必要時安裝專用散熱通道；操作人員應配備厚型隔熱手套、護目鏡/麵具以及防護外套以確保安全。

幹細胞製劑的存儲須杜絕交叉汙染，設置合格、待檢與不合格區且標識明顯；集約設計監控裝置，實現24 h溫度連續監控及遠程報警，確保液體供氣係統不間斷供氣及外置塔的安全運轉(儲存、調壓、氣化等)，設置保護圍欄和安全警示標識並定期安全檢查，校驗供氣管道與遠程液位監控係統，對於液氮補給罐或液氮輸送係統所有閥門、壓力表與安全閥應定期檢查(年檢或強檢)，確保係統連續平穩、安全節氣，液氮設備的運行與維修人員應具備《特種行業資格證》，可外包給專業公司進行檢修。

所有設備應建檔受控，專人管理且標識唯一，分光光度計、移液器、天平、離心機等需定期進行計量檢定與校準。實驗室必備的安全設施(通風櫥、防塵罩、滅火器、洗眼噴淋裝置等)應定期進行檢查。

采集、製備與檢驗

采集前，需對供者進行入組篩查和傳染病因子檢測，包括人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類嗜T細胞病毒、EB病毒、巨細胞病毒、梅毒螺旋體等；篩查合格的供者簽署知情同意書後，遵循標準操作規程采集樣本，將汙染、感染和病原體傳播的風險降到最低。

臨床級幹細胞的製備應嚴謹、審慎並進行獨立審查和監督，確保其安全性和有效性。即使對細胞進行最小的體外操作都有可能引入額外風險，如病原體汙染、培養代數增加導致的細胞基因型和表型不穩定，在長期、壓力環境下可能會變為非整倍體或發生DNA重組、缺失及其他基因或表觀遺傳異常，從而帶來嚴重病理改變，如癌症。故臨床級幹細胞的製備應遵循GMP程序，防止原料和產品在生產過程中被汙染，所有試劑與製備過程均應遵守質量控製體係與規程，確保試劑質量、製備工藝與製定的方案保持一致，形成細胞鑒定、純度和潛能分析標準，而對於傳染病因子陽性的幹細胞製備需在獨立設置的陽性間進行。

過程中的關鍵性物料必須做到：

先驗證性能，確保有效性且符合國家相關規定；

直接與原始樣本及幹細胞製劑接觸的物料必須無菌且對人體無害並符合要求的級別，盡可能使用藥用級別的物料；

非無菌物料和非一次性物料必須清潔和滅菌，滅菌合格並被監控；

記錄使用的關鍵物料，確保可完整準確地追蹤到每個環節中物料的詳細信息，包括使用的試劑/耗材/設備清單、生產廠家、批次號、合格證等，關鍵試劑如血清、酶和生長因子的分析證書(certificate of analysis，COA)副本，測試過程和結果等。

在細胞培養或保存時除了盡可能避免使用抗生素外，還應避免使用動物源性或成分不明確的試劑、人源或動物源性血清，動物源性成份應盡可能用規定的化學成份替代，禁止使用同種異體人血清或血漿，以確保幹細胞製劑的質量。

臨床級幹細胞製劑的檢驗分為全麵質量檢驗、複核檢驗和放行檢驗，為確保幹細胞治療的安全性和有效性，每批幹細胞製劑均須符合現有幹細胞知識和技術條件下的全麵質量要求,參見《幹細胞製劑質量控製及臨床前研究指導原則(試行)》。

標識、存儲和發放

一、 標識

每份幹細胞製劑應分配唯一的編碼，編碼規則應具唯一性和統一性，通過編碼可追溯到捐贈者和製劑存放位置及處理等所有信息，標簽應耐低溫耐潮濕。可以使用國際血庫自動化委員會推薦的ISBT128碼。隨著自動化設備的使用，容器自帶編碼(如激光蝕刻)、無線射頻識別電子標簽等的出現，人為編碼打印和手工粘貼標簽將逐步被新模式所取代。

二、 存儲

（一）冷凍保存

冷凍保存過程中應避免冰晶與溶質損傷。可使用程序降溫儀或其他替代方法(如Nalgene程序降溫盒)控製降溫速度，並使用二甲基亞碸或甘油冷凍保護劑。為防止不可抗性因素所導致的損壞或丟失，需將同一來源的細胞分成若幹份，分放不同區域的不同容器中長期保存即鏡像保存(mirror image storage)。對於幹細胞的長期存儲，國際公認使用氣相液氮罐較理想，保存的溫度為-150 ℃～-196 ℃，需關注幹細胞穩定儲存的時間以及如何在儲存中防止汙染等。隨著自動化液氮存儲設備的出現和發展，幹細胞存取將走向自動化和智能化。

（二）容器

避免因容器滲漏而導致的交叉汙染。容器應明確標識，且具有無菌、化學耐受、無吸附(對細胞、蛋白、RNA和 DNA)、無酶、密封(帶螺紋)、耐低溫等特性，限一次性使用，不含有幹擾物質。臨床級幹細胞容器的無菌保證水平要求為10*-6(99.999 999%)，即一百萬件產品中可能存在活微生物的概率為1。應使用能足夠防漏、抗振、抗壓力、抗溫度變化、防刺穿和其他事故材料製成的外容器運輸幹細胞，一般使用幹式液氮罐作為外容器進行轉運。

三、審核、放行與分發

幹細胞在分發前必須進行審核與放行控製，審核與放行的程序和記錄既是質量保證/質量控製架構的縮影，也是製備過程中產生的科學數據的存儲。審核與放行通過取走最終樣本進行測試、成品細胞標識和運輸，證明幹細胞從正式進入實驗室係統到實現預期功能的整個過程。

幹細胞的放行處理是通過選擇實用、快速、科學可控的放行檢驗獲得COA或放行檢測報告後實施的。COA總結了產品的特性、所進行的測試、分發時能否提供結果並詳細介紹放行的標準和每一個測試結果、測試使用方法、敏感度或可接受的結果範圍。測試結果的放行標準一般來自法規、臨床研究申請及文獻。證書必須經檢測者、檢測負責人和質量授權人審核並簽署，隨細胞一起發布。因此，應建立放行後測試結果和所有記錄的相關審核程序，以及放行後測試結果不符合規定要求的應對機製。

臨床級幹細胞庫應規定保存條件、周期及銷毀的規範，避免混淆、汙染、交叉汙染和不合理的分發。發放的細胞治療產品應明確給出新鮮和冷藏後複蘇產品的失效日期和時間。分發後幹細胞製劑的運輸和轉送程序要確保其完整性及人員的健康和衛生，需經過驗證在維持細胞活力和功能完整性的情況下運輸或轉運到輸注現場，幹細胞的轉運應由訓練有素的物流人員或商業運輸公司監管，應有證據表明在運輸中保持合適的溫度。溫度記錄儀的使用現在最為廣泛，運輸過程中的溫度應符合收集機構標準操作規程手冊的要求。

四、信息管理係統

臨床級幹細胞庫信息管理係統的構建需根據其用途和功能來構建，著眼於幹細胞全生命周期的數據跟蹤，實現雙向性追溯，應從幹細胞臨床研究全過程進行布局，實現從臨床中來到臨床中去的閉環管理。